Un componente importante de la investigación biotecnológica es el uso de técnicas de ingeniería de proteínas para diseñar o modificar proteínas. Estas técnicas de purificación de proteínas optimizan las propiedades de proteínas para aplicaciones industriales específicas.
Estas técnicas requieren que los científicos aíslen y purifiquen las proteínas de interés para poder estudiar sus conformaciones y especificidades de sustrato. También requieren estudio las reacciones con otros ligandos (una proteína que se une a una proteína receptora) y actividades enzimáticas específicas.
El grado de pureza de la proteína requerida depende del uso final previsto de la proteína. Para algunas aplicaciones, un extracto crudo es suficiente. Otros usos, como en alimentos y productos farmacéuticos, requieren un alto nivel de pureza. Varias técnicas para purificación de proteínas se utilizan para alcanzar el nivel de pureza requerido.
Desarrollar una estrategia
Cada paso de purificación de proteínas generalmente produce cierto grado de pérdida de producto. Por lo tanto, una estrategia ideal de purificación de proteínas es aquella en la que se alcanza el nivel más alto de purificación en la menor cantidad de pasos.
La selección de qué pasos usar depende del tamaño, la carga, la solubilidad y otras propiedades de la proteína objetivo. Las siguientes técnicas son las más apropiadas para purificar una sola proteína citosólica.
La purificación de complejos de proteínas citosólicas es más complicada y generalmente requiere la aplicación de diferentes métodos.
Preparar un extracto crudo
El primer paso para purificar proteínas intracelulares (dentro de la célula) es la preparación de un extracto crudo. El extracto contendrá una mezcla compleja de todas las proteínas del citoplasma celular y algunas macromoléculas, cofactores y nutrientes adicionales.
Este extracto crudo puede usarse para algunas aplicaciones en biotecnología. Sin embargo, si la pureza es un problema, se deben seguir los siguientes pasos de purificación. Los extractos de proteínas crudas se preparan mediante la eliminación de los desechos celulares generados por la lisis celular, que se logra utilizando productos químicos, enzimas, sonicación o una prensa francesa.
Retire los escombros del extracto
Los desechos se eliminan por centrifugación y se recupera el sobrenadante (el líquido sobre un residuo sólido). Las preparaciones crudas de proteínas extracelulares (fuera de la célula) se pueden obtener simplemente eliminando las células por centrifugación.
Por cierto biotecnología En aplicaciones, existe una demanda de enzimas termoestables, enzimas que pueden tolerar altas temperaturas sin desnaturalizar, mientras mantienen una alta actividad específica.
Los organismos que producen proteínas resistentes al calor a veces se llaman extremófilos. Un enfoque fácil para purificar una proteína resistente al calor es desnaturalizar las otras proteínas en la mezcla mediante calentar, luego enfriar la solución (permitiendo que la enzima termoestable se reforme o vuelva a disolver, si necesario). Las proteínas desnaturalizadas se pueden eliminar por centrifugación.
Pasos intermedios de purificación de proteínas
Moderno biotecnología Los protocolos a menudo aprovechan los muchos kits o métodos disponibles comercialmente que proporcionan soluciones listas para los procedimientos estándar. La purificación de proteínas a menudo se realiza usando filtros y columnas preparadas de filtración en gel.
Kit de diálisis
Siga las instrucciones del kit de diálisis y agregue el volumen correcto de la solución correcta y espere período de tiempo especificado mientras se recolecta el eluyente (el solvente pasó a través de la columna) en una nueva prueba tubo.
Métodos cromatográficos
Los métodos cromatográficos se pueden aplicar utilizando columnas de mesa o equipos de HPLC automatizados. La separación por HPLC se puede hacer mediante métodos de fase inversa, intercambio iónico o exclusión de tamaño, y muestras detectadas por la matriz de diodos o la tecnología láser.
Precipitación
En el pasado, un segundo paso común para purificar una proteína de un extracto crudo era por precipitación en una solución con alta fuerza osmótica (es decir, soluciones salinas). La precipitación de proteínas generalmente se realiza utilizando sulfato de amonio como sal. Los ácidos nucleicos en el extracto crudo se pueden eliminar precipitando los agregados formados con sulfato de estreptomicina o sulfato de protamina.
La precipitación de sal generalmente no conduce a una proteína altamente purificada, pero puede ayudar a eliminar algunas proteínas no deseadas en una mezcla y concentrar la muestra. Las sales en la solución se eliminan por diálisis a través de tubos de celulosa porosa, filtración o cromatografía de exclusión de gel.
Diferentes proteínas precipitarán en diferentes concentraciones de sulfato de amonio. En general, las proteínas de mayor peso molecular precipitan en concentraciones más bajas de sulfato de amonio.
Visualización de proteínas y evaluación de purificación
La cromatografía de fase inversa (RPC) separa las proteínas en función de sus hidrofobicidades relativas (exclusión de moléculas no polares del agua). Esta técnica es altamente selectiva pero requiere el uso de solventes orgánicos.
Algunas proteínas son desnaturalizadas permanentemente por solventes y perderán funcionalidad durante RPC. Por lo tanto, este método no se recomienda para todas las aplicaciones, particularmente si es necesario que la proteína objetivo retenga actividad.
Intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico se refiere a la separación de proteínas en función de la carga. Las columnas pueden prepararse para el intercambio aniónico o catiónico. Las columnas de intercambio aniónico contienen una fase estacionaria con una carga positiva que atrae proteínas cargadas negativamente.
Intercambio de cationes y filtración en gel
Las columnas de intercambio de cationes son las perlas inversas cargadas negativamente que atraen proteínas cargadas positivamente. La elución (extracción de un material de otro) de las proteínas objetivo se realiza cambiando el pH en la columna, que da como resultado un cambio o neutralización de los grupos funcionales cargados de cada proteína.
La cromatografía de exclusión por tamaño (también conocida como filtración en gel) separa las proteínas más grandes de las más pequeñas unos ya que las moléculas más grandes viajan más rápido a través del polímero reticulado en la cromatografía columna. Las proteínas grandes no encajan en los poros del polímero, mientras que las proteínas más pequeñas sí, y tardan más en viajar a través de la columna de cromatografía, a través de una ruta menos directa.
El eluato (el resultado de la elución) se recoge en una serie de tubos que separan las proteínas en función del tiempo de elución. La filtración en gel es una herramienta útil para concentrar una muestra de proteína, ya que la proteína objetivo se recoge en un volumen de elución más pequeño que el que se agregó inicialmente a la columna. Se pueden utilizar técnicas de filtración similares durante la producción de proteínas a gran escala debido a su rentabilidad.
Cromatografía de afinidad y electroforesis
La cromatografía de afinidad es una técnica muy útil para "pulir" o completar el proceso de purificación de proteínas. Las cuentas en la columna de cromatografía están entrecruzadas con ligandos que se unen específicamente a la proteína objetivo.
Luego, la proteína se elimina de la columna enjuagando con una solución que contiene ligandos libres. Este método proporciona los resultados más puros y la mayor actividad específica en comparación con otras técnicas.
SDS-PAGE (dodecil sulfato de sodio usado con electroforesis en gel de poliacrilamida) se une a las proteínas dándoles una gran carga negativa neta. Dado que las cargas de todas las proteínas son bastante iguales, este método las separa casi por completo en función del tamaño.
SDS-PAGE a menudo se usa para probar la pureza de la proteína después de cada paso de una serie. A medida que las proteínas no deseadas se eliminan gradualmente de la mezcla, el número de bandas visualizadas en el gel SDS-PAGE se reduce, hasta que solo haya una banda que represente la proteína deseada.
Inmunotransferencia
La inmunotransferencia es una técnica de visualización de proteínas aplicada en combinación con cromatografía de afinidad. Los anticuerpos para una proteína específica se usan como ligandos en una columna de cromatografía de afinidad.
La proteína objetivo se retiene en la columna, luego se elimina enjuagando la columna con una solución de sal u otros agentes. Los anticuerpos vinculados a las etiquetas radiactivas o de colorante ayudan a detectar la proteína objetivo una vez que se separa del resto de la mezcla.