La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de genética molecular para hacer múltiples copias de un gen y también es parte del proceso de secuenciación de genes.
Cómo funciona la reacción en cadena de la polimerasa
Las copias de genes se hacen usando una muestra de ADN, y la tecnología es lo suficientemente buena como para hacer múltiples copias de una sola copia del gen que se encuentra en la muestra. La amplificación por PCR de un gen para hacer millones de copias permite la detección e identificación de secuencias de genes mediante técnicas visuales basadas en el tamaño y la carga (+ o -) del fragmento de ADN.
En condiciones controladas, los pequeños segmentos de ADN son generados por enzimas conocidas como ADN polimerasas, que agregan desoxinucleótidos complementarios. (dNTP) a un fragmento de ADN conocido como "plantilla". Incluso fragmentos de ADN más pequeños, llamados "cebadores", se utilizan como punto de partida para polimerasa.
Los cebadores son pequeñas piezas de ADN hechas por el hombre (oligómeros), generalmente entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. Se obtienen conociendo o adivinando secuencias cortas de ADN en los extremos del gen que se amplifica. Durante la PCR, el ADN que se está secuenciando se calienta y las hebras dobles se separan. Al enfriarse, los cebadores se unen a la plantilla (llamado recocido) y crean un lugar para que comience la polimerasa.
La técnica de PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue posible gracias al descubrimiento de termófilos y termófilos. enzimas polimerasas (enzimas que mantienen la integridad estructural y la funcionalidad después de calentar a alta temperaturas). Los pasos involucrados en la técnica de PCR son los siguientes:
- Se crea una mezcla con concentraciones optimizadas de la plantilla de ADN, la enzima polimerasa, los cebadores y los dNTP. La capacidad de calentar el mezcla sin desnaturalizar la enzima permite desnaturalizar la doble hélice de la muestra de ADN a temperaturas en el rango de 94 grados Celsius.
- Después de la desnaturalización, la muestra se enfría a un rango más moderado, alrededor de 54 grados, lo que facilita el apareamiento (unión) de los cebadores a las plantillas de ADN monocatenario.
- En el tercer paso del ciclo, la muestra se recalienta a 72 grados, la temperatura ideal para la ADN polimerasa Taq, para el alargamiento. Durante el alargamiento, la ADN polimerasa utiliza la hebra única original de ADN como plantilla para agregar dNTP complementarios. a los extremos 3 'de cada cebador y generar una sección de ADN de doble hebra en la región del gen de interés.
- Los cebadores que se han hibridado con secuencias de ADN que no coinciden exactamente no permanecen hibridados a 72 grados, lo que limita la elongación del gen de interés.
Este proceso de desnaturalización, hibridación y alargamiento se repite múltiples (30-40) veces, aumentando así exponencialmente el número de copias del gen deseado en la mezcla. Aunque este proceso sería bastante tedioso si se realizara manualmente, las muestras se pueden preparar e incubar en un termociclador programable, ahora común en la mayoría de los laboratorios moleculares, y se puede realizar una reacción de PCR completa en 3-4 horas.
Cada paso de desnaturalización detiene el proceso de elongación del ciclo anterior, truncando así la nueva hebra de ADN y manteniéndola en aproximadamente el tamaño del gen deseado. La duración del ciclo de elongación puede alargarse o acortarse dependiendo del tamaño del gen de interés, pero eventualmente, a través de ciclos repetidos de PCR, la mayoría de las plantillas estarán restringidas al tamaño del gen de interés solo, ya que se habrán generado a partir de productos de ambos imprimaciones.
Hay varios diferentes factores para una PCR exitosa que se puede manipular para mejorar los resultados. El método más utilizado para analizar la presencia de producto de PCR es electroforesis en gel de agarosa. Que se utiliza para separar fragmentos de ADN según el tamaño y la carga. Luego, los fragmentos se visualizan usando tintes o radioisótopos.
La evolución
Desde el descubrimiento de la PCR, se han descubierto ADN polimerasas distintas de la Taq original. Algunos de estos tienen una mejor capacidad de "corrección de pruebas" o son más estables a temperaturas más altas, mejorando así la especificidad de la PCR y reduciendo los errores de la inserción del dNTP incorrecto.
Algunas variaciones de la PCR se han diseñado para aplicaciones específicas y ahora se utilizan con regularidad en los laboratorios de genética molecular. Algunos de estos son PCR en tiempo real y PCR con transcriptasa inversa. El descubrimiento de la PCR también ha conducido al desarrollo de la secuenciación del ADN, huella de ADN y otras técnicas moleculares.