Técnicas para secuenciar ADN

El campo de biotecnología Es uno de cambio constante. El rápido crecimiento y desarrollo de la investigación de vanguardia dependen de la innovación y la creatividad de Los científicos y su capacidad de ver el potencial en una técnica molecular básica y aplicarla a nuevos procesos. El advenimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) abrió muchas puertas en la investigación genética, incluido un medio de Análisis de ADN e identificación de diferentes genes en función de sus secuencias de ADN. La secuenciación del ADN también depende de nuestra capacidad de uso electroforesis en gel para separar cadenas de ADN que difieren en tamaño en tan solo un par de bases.

A fines de la década de 1970, se inventaron dos técnicas de secuenciación de ADN para moléculas de ADN más largas: el método Sanger (o didesoxi) y el método Maxam-Gilbert (escisión química). El método de Maxam-Gilbert se basa en la escisión específica de nucleótidos por productos químicos y se utiliza mejor para secuenciar oligonucleótidos (polímeros de nucleótidos cortos, generalmente de menos de 50 pares de bases de longitud). El método Sanger se usa más comúnmente porque se ha demostrado que es técnicamente más fácil de aplicar y, con El advenimiento de la PCR y la automatización de la técnica, se aplica fácilmente a largas cadenas de ADN, incluyendo algunos genes Esta técnica se basa en la terminación de la cadena por didesoxinucleótidos durante las reacciones de elongación por PCR.

En el método de Sanger, la cadena de ADN a analizar se usa como plantilla y la ADN polimerasa se usa, en una reacción de PCR, para generar cadenas complementarias usando cebadores. Se preparan cuatro mezclas de reacción de PCR diferentes, cada una con un cierto porcentaje de análogos de didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP) a uno de los cuatro nucleótidos (ATP, CTP, GTP o TTP).

La síntesis de la nueva cadena de ADN continúa hasta que se incorpora uno de estos análogos, momento en el cual la cadena se trunca prematuramente. Cada reacción de PCR terminará conteniendo una mezcla de diferentes longitudes de cadenas de ADN, todas terminando con el nucleótido marcado con didesoxi para esa reacción. Gel electroforesis luego se usa para separar las cadenas de las cuatro reacciones, en cuatro líneas separadas, y determinar la secuencia de la plantilla original en función de qué longitudes de cadenas terminan con qué nucleótido.

En la reacción automatizada de Sanger, se usan cebadores que están marcados con cuatro etiquetas fluorescentes de diferentes colores. Las reacciones de PCR, en presencia de los diferentes didesoxinucleótidos, se realizan como se describió anteriormente. Sin embargo, a continuación, las cuatro mezclas de reacción se combinan y se aplican a una sola línea de un gel. El color de cada fragmento se detecta utilizando un rayo láser y la información es recopilada por una computadora que genera cromatogramas que muestran picos para cada color, a partir de los cuales puede ser la secuencia de ADN plantilla determinado.

Por lo general, el método de secuenciación automática solo es preciso para secuencias de hasta un máximo de aproximadamente 700-800 pares de bases de longitud. Sin embargo, es posible obtener secuencias completas de genes más grandes y, de hecho, genomas completos, utilizando métodos escalonados como Primer Walking y secuenciación de escopeta.

En Primer Walking, una porción viable de un gen más grande se secuencia usando el método Sanger. Los nuevos cebadores se generan a partir de un segmento confiable de la secuencia y se usan para continuar secuenciando la porción del gen que estaba fuera del rango de las reacciones originales.

La secuencia de escopeta implica cortar aleatoriamente el segmento de ADN de interés en el más apropiado (manejable) fragmentos de tamaño, secuenciando cada fragmento y ordenando las piezas en base a la superposición secuencias Esta técnica se ha facilitado mediante la aplicación de software para organizar las piezas superpuestas.