Procedimiento de tinción de Gram en microbiología

La tinción de Gram es un método diferencial de tinción utilizado para asignar bacterias a uno de dos grupos (grampositivo y gramnegativo) en función de las propiedades de sus paredes celulares. También se conoce como tinción de Gram o método de Gram. El procedimiento lleva el nombre de la persona que desarrolló la técnica, el bacteriólogo danés Hans Christian Gram.

El procedimiento se basa en la reacción entre peptidoglicano en las paredes celulares de algunas bacterias. La tinción de Gram implica la tinción de bacterias, la fijación del color con un mordiente, la decoloración de las células y la aplicación de una contratinción.

1. La mancha primaria (cristal violeta) se une al peptidoglicano, coloreando las células de color púrpura. Tanto las células grampositivas como las gramnegativas tienen peptidoglicano en sus paredes celulares, por lo que inicialmente, todas las bacterias se tiñen de violeta.
2. El yodo de Gram (yodo y yoduro de potasio) se aplica como mordiente o fijador. Las células grampositivas forman un complejo de cristal violeta-yodo.
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3. Alcohol o acetona se usa para decolorar las células. Las bacterias gramnegativas tienen mucho menos peptidoglicano en sus paredes celulares, por lo que este paso los vuelve esencialmente incoloros, mientras que solo se elimina parte del color de las células grampositivas, que tienen más peptidoglucano (60-90% de la pared celular). La pared celular gruesa de las células grampositivas se deshidrata por el paso de decoloración, lo que hace que se encojan y atrapen el complejo de manchas de yodo en el interior.
4. Después del paso de decoloración, se aplica una contratinción (generalmente safranina, pero a veces fucsina) para colorear la bacteria de rosa. Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas recogen la mancha rosada, pero no es visible sobre el púrpura más oscuro de las bacterias grampositivas. Si el procedimiento de tinción se realiza correctamente, las bacterias gram positivas serán de color púrpura, mientras que las bacterias gram negativas serán de color rosa.

Se ven los resultados de la tinción de Gram usando microscopía de luz. Debido a que las bacterias son de color, no solo se identifica su grupo de tinción de Gram, sino que también su forma, tamaño y patrón de agrupamiento pueden ser observados. Esto hace que la tinción de Gram sea una valiosa herramienta de diagnóstico para una clínica médica o laboratorio. Si bien la mancha puede no identificar definitivamente las bacterias, a menudo saber si son grampositivas o gramnegativas es suficiente para prescribir un antibiótico efectivo.

Algunas bacterias pueden ser gram-variables o gram-indeterminadas. Sin embargo, incluso esta información puede ser útil para reducir la identidad bacteriana. La técnica es más confiable cuando los cultivos tienen menos de 24 horas. Si bien se puede usar en cultivos de caldo, es mejor centrifugarlos primero. La principal limitación de la técnica es que produce resultados erróneos si se cometen errores en la técnica. Se necesita práctica y habilidad para producir un resultado confiable. Además, un agente infeccioso puede no ser bacteriano. Los patógenos eucariotas se tiñen de gramnegativos. Sin embargo, la mayoría células eucariotas excepto los hongos (incluida la levadura) no se adhieren al portaobjetos durante el proceso.

• Cristal violeta (mancha primaria)
• Gram's yodo (mordiente, para fijar cristal violeta en la pared celular)
• Etanol o acetona (decolorante)
• Safranina (mancha secundaria o contratinción)
• Agua en una botella con atomizador o gotero
• Portaobjetos de microscopio
• Microscopio compuesto

1. Coloque una pequeña gota de muestra bacteriana en un portaobjetos. Calor fije las bacterias al portaobjetos pasándolo tres veces a través de la llama de un mechero Bunsen. Aplicar demasiado calor o durante demasiado tiempo puede derretir las paredes celulares de las bacterias, distorsionando su forma y dando lugar a un resultado inexacto. Si se aplica muy poco calor, la bacteria se lavará del portaobjetos durante la tinción.
2. Usa un gotero para aplicar la mancha primaria (violeta cristal) al portaobjetos y deja que repose durante 1 minuto. Enjuague suavemente el portaobjetos con agua no más de 5 segundos para eliminar el exceso de manchas. Enjuagar demasiado puede eliminar demasiado color, mientras que no enjuagar lo suficiente puede permitir que quede demasiada mancha en las células gramnegativas.
3. Use un gotero para aplicar el yodo de Gram al portaobjetos para fijar el cristal violeta a la pared celular. Déjalo reposar por 1 minuto.
4. Enjuague el portaobjetos con alcohol o acetona durante aproximadamente 3 segundos, seguido inmediatamente con un enjuague suave con agua. Las células gramnegativas perderán color, mientras que las células gramnegativas permanecerán violetas o azules. Sin embargo, si el decolorante se deja demasiado tiempo, ¡todas las celdas perderán color!
5. Aplique la mancha secundaria, safranina, y deje reposar durante 1 minuto. Enjuague suavemente con agua no más de 5 segundos. Las células gramnegativas deben teñirse de rojo o rosa, mientras que las células gram positivas seguirán apareciendo de color púrpura o azul.
6. Ver la diapositiva con un microscopio compuesto. Puede ser necesario un aumento de 500x a 1000x para distinguir la forma y disposición de la celda.

No todas las bacterias identificadas por la tinción de Gram están asociadas con enfermedades, pero algunos ejemplos importantes incluyen:

• Cocos grampositivos (redondos):Staphylococcus aureus
• Cocos gramnegativos:Neisseria meningitidis
• Bacilos Gram-positivos (varillas): Bacillus Anthracis
• Bacilos gramnegativos:Escherichia coli